Одним из главных условий применения клеточной терапии в практической медицине является обеспечение безопасности ее проведения. Вопросам генетической безопасности клеточных трансплантатов до последнего времени уделялось недостаточно внимания. Между тем, культивирование клеток может приводить к возникновению клеток с аберрантным кариотипом и их позитивной селекции в популяции, что может явиться причиной «загрязнения» клеточного трансплантата. Генетически аберрантные клетки в организме реципиента рано или поздно могут стать «бомбой замедленного действия» в отношении злокачественного роста или нарушений иммунитета. Одним из методов оценки генетической безопасности является цитогенетическое исследование. Оно позволяет определить генетическую стабильность клеточных линий и выявлять линии, несущие хромосомные перестройки.

Цель работы - разработка алгоритма и проведение цитогенетического анализа стволовых клеток человека. Исследование было проведено на культурах мультипотентных стромальных клеток (МСК), полученных из жировой ткани взрослых индивидов на ранних (3-4) и поздних (10-14) пассажах.

Разработана методика цитогенетического исследования МСК человека. Определены условия культивирования клеток, отработана методика фиксации культур и приготовления цитогенетических препаратов. Цитогенетические параметры безопасности стволовых клеток изучались по двум позициям: кариотипирование и оценка уровня геномных мутаций анеуплоидии и полиплоидии.

При анализе дифференциально окрашенных (G-окраска) препаратов МСК на 4-14 пассажах в отдельных культурах выявлены клоны с измененными кариотипами (моносомия по 6 ой хромосоме, робертсоновская транслокация 21/22, трисомия по двум хромосомам группы С). Для анализа уровня анеуплоидии и полиплоидии была применена методика флуоресцентной гибридизации in situ (FISН) с центромерными зондами на хромосомы 6 и 8. Обнаружена повышенная частота анеу- и полиплоидных клеток в культурах поздних пассажей (10-14).

Экспериментальная работа с культурами МСК показала, что методические приемы (снятие клеток с флаконов, гипотонизация, фиксация) для приготовления цитогенетических препаратов должны быть щадящими. Разорванных клеток с разбросанными хромосомами встречается много больше, чем в препаратах из культур лимфоцитов. Может быть, по этой причине мало опубликованных работ по анализу хромосомных наборов в культурах региональных стволовых клеток.

В 50% культур МСК поздних пассажей обнаружена хромосомная изменчивость, которая выражается в виде нестабильных хромосомных аберраций, транслокаций хромосом и анеуплоидий. Значимость таких изменений пока не ясна, но вряд ли они безразличны для судьбы клеток, которые после культивирования будут трансплантированы в организм. При этом надо иметь в виду, что примененные в данной работе методы позволяют учитывать только крупные хромосомные аномалии и анеуплоидии, а использование молекулярно-цитогенетических методов может выявить их еще в большем масштабе.

Из наших наблюдений следует, что имеет место селективное размножение клеток с аномальным кариотипом. Следовательно, необходим цитогенетический контроль стволовых/прогениторных клеток перед их трансплантацией, как часть системы обеспечения безопасности клеточной терапии. Клеточная терапия тем безопаснее, чем меньше делений пройдет в культуре стволовых клеток.

Тезисы докладов Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении».